La microscopie à force fluidique (FluidFM) combine la microscopie à force atomique (AFM) avec des sondes à microcanaux connectées à un contrôleur de pression qui permet des expériences avec des nanopipettes sensibles à la force dans des conditions aqueuses.
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FluidFM offre des avantages uniques dans la manipulation tridimensionnelle simultanée et les mesures mécaniques d’une large gamme de matériaux micro et nanométriques, y compris des échantillons biologiques, des semi-conducteurs, des polymères et des nanoparticules colloïdales.
L’AFM est une technique de caractérisation largement utilisée en science des matériaux, en électronique, en recherche biomédicale et dans de nombreux autres domaines de recherche. Depuis son invention en 1986 par Gerd Binnig, Calvin Quate et Christoph Gerber, la technique AFM a subi de nombreuses améliorations et est devenue un outil d’imagerie de surface largement utilisé.
La technique a évolué à partir de la microscopie à effet tunnel (STM), qui se limite uniquement à la caractérisation des matériaux électriquement conducteurs. En revanche, l’AFM permet l’imagerie à résolution atomique d’une grande variété de matériaux en balayant une sonde ultra-pointue attachée à un porte-à-faux flexible sur la surface de l’échantillon.
La déflexion du porte-à-faux est surveillée par un faisceau laser réfléchi par la surface du porte-à-faux, permettant la quantification de la variation des forces d’interaction entre la sonde et la surface de l’échantillon.
Une image topographique de la surface de l’échantillon est acquise à une résolution inférieure au nanomètre en corrélant la déviation en porte-à-faux avec la position de la sonde de balayage sur l’échantillon. En même temps, la technique permet d’obtenir des informations quantitatives sur les propriétés mécaniques de l’échantillon.
Technique de caractérisation de choix pour les applications biologiques
Après être devenu un outil d’imagerie de surface de choix pour la science des semi-conducteurs et des matériaux, l’AFM est de plus en plus utilisé dans la recherche biologique pour la caractérisation des organites cellulaires, la quantification des interactions protéine-protéine et ADN-protéine, les forces d’adhésion cellulaire et les propriétés électromécaniques des organismes vivants. . cellules.
En raison de sa compatibilité avec les environnements aqueux, l’AFM est considérée comme l’une des meilleures méthodes non invasives pour étudier des échantillons biologiques en temps réel dans des conditions physiologiques.
Au cours des trois dernières décennies, la technique AFM a subi de nombreuses améliorations qui ont élargi le champ de son application, y compris la lithographie à l’échelle nanométrique, ainsi que la caractérisation électrique et magnétique des échantillons. L’une de ces avancées est FluidFM, qui combine l’AFM conventionnel avec des sondes à microcanaux pour la distribution locale de liquide via un circuit nanofluidique. La technologie a été initialement développée en 2009 dans le groupe du professeur Tomaso Zambelli à l’Ecole polytechnique fédérale de Zurich (ETH Zürich, Suisse) et a ensuite été améliorée et commercialisée par la société dérivée Cytosurge.
La technique FluidFM est basée sur l’utilisation d’un nouveau type de porte-à-faux avec une pointe creuse et un microcanal intégré à l’intérieur, qui permet de contrôler les volumes de liquide en femtolitres avec une précision spatiale nanométrique et une résolution de force picoNewton. Cette approche permet l’isolement et l’injection de cellules individuelles, le serrage de patchs de cellules vivantes à force contrôlée et la manipulation d’objets à l’échelle micro et nanométrique.
Biophysique et manipulation des cellules vivantes
En plaçant la sonde FluidFM dans une cellule individuelle et en appliquant une pression négative sur le canal fluidique, la cellule peut être fermement fixée à l’ouverture de la pointe de la sonde et récupérée du substrat. En inversant la pression, la cellule peut être placée à l’endroit souhaité.
Grâce aux manipulations unicellulaires basées sur FluidFM, les chercheurs ont pu transférer des cellules vers des zones spécifiques pour étudier le comportement cellulaire ou éliminer les cellules indésirables pour faciliter la formation de colonies cellulaires.
La capacité de manipuler des cellules vivantes individuelles s’est avérée cruciale pour les expériences de spectroscopie de force unicellulaire (où les interactions cellule-substrat ou cellule-cellule sont caractérisées). De plus, la technique FluidFM a permis l’électrophysiologie unicellulaire en mesurant simultanément la réponse mécanique de la cellule et en enregistrant le courant ionique dans des expériences de patch-clamp.
Nanoinjection pour le génie génétique CRISPR
Depuis sa découverte et son développement en tant que technologie d’édition de gènes, CRISPR a révolutionné la recherche biomédicale en offrant un outil de génie génétique polyvalent adapté à un large éventail d’organismes et d’applications, telles que la guérison des maladies génétiques, la création de cultures résistantes à la sécheresse et l’élimination des maladies. . Projets
La méthode nécessite une livraison précise de plusieurs molécules d’ARN guide dans les cellules cibles, ce qui est loin d’être trivial lors de l’utilisation de méthodes de transfection traditionnelles (où la viabilité cellulaire peut être entravée par le stress et la toxicité).
Cytosurge a développé une solution de manipulation de gènes hautement automatisée appelée FluidFM OMNIUM qui peut délivrer en douceur et avec précision les composés nécessaires directement dans le noyau de n’importe quelle cellule. Cela garantit que tous les réactifs ont la stoechiométrie optimale pour maximiser l’efficacité et éliminer le stress cellulaire.
Par rapport aux stratégies de développement de lignées cellulaires conventionnelles, où il faut 12 à 14 semaines pour obtenir des lignées cellulaires monoclonales stables, la technique FluidFM peut sélectionner, nanoinjecter et cloner une seule cellule en moins de trois semaines de la transfection aux clones sont caractérisés.
Le système FluidFM OMNIUM permet aux chercheurs de cibler les noyaux de quelques dizaines de cellules individuelles avec une simple approche pointer-cliquer, conduisant à une injection automatique dans les cellules ciblées à un rythme d’environ cinq cellules par minute. . Parallèlement à tous les différents complexes d’ARN guide et de protéines, un marqueur fluorescent a été co-injecté dans les cellules traitées pour contrôler le processus d’injection et identifier les cellules traitées.
Après 24 heures, les cellules cibles ont été trouvées et isolées à l’aide de la sonde de micropipette FluidFM et transférées dans un puits vide pour assurer la monoclonalité de la lignée cellulaire résultante.
Impression 3D à l’échelle nanométrique
La technologie FluidFM permet également l’impression 3D de structures complexes au niveau du micron, y compris des géométries difficiles à imprimer telles que les porte-à-faux. L’équipe de spécialistes de Cytosurge a développé une technologie propriétaire de micro-impression 3D qui, en 2019, est devenue une société indépendante appelée Exaddon AG.
La dernière génération de l’imprimante 3D CERES de la société combine un positionnement précis au nanomètre, une distribution de liquide à air forcé, un dépôt électrochimique et un retour de force optique. À l’aide de sondes de nanopipette FluidFM, le système dépose une solution d’ions métalliques, qui est ensuite solidifiée par un processus de galvanoplastie qui se déroule à température ambiante.
L’imprimante CERES Micro 3D offre un volume d’impression de 200x200x200 µm, tandis que la boucle de retour de force optique mesure les forces agissant sur la pointe d’impression et permet une surveillance en temps réel du processus d’impression, garantissant l’achèvement de chaque voxel jusqu’à l’objet entier est construit.
Un tel contrôle sur site du processus d’impression conduit à des microstructures métalliques de haute qualité qui sont immédiatement prêtes à l’emploi sans nécessiter de traitement supplémentaire.
Continuer la lecture : Détermination de la viscosité des nanofluides : techniques et applications
Références et lectures complémentaires
Li, M. et coll. (2022) FluidFM pour la biophysique unicellulaire. Nano Rés. quinze, 773–786. Disponible en: https://doi.org/10.1007/s12274-021-3573-y
P.Monnier et al. (2021) La nanoinjection FluidFM surmonte les limitations de livraison des méthodes actuelles d’édition de gènes CRISPR, accélère les cycles de développement de lignées cellulaires et est sur le point d’étendre considérablement les capacités de multiplexage. [Online] Nouvelles de la médecine CRISPR. Disponible en: https://crisprmedicinenews.com/news/fluidfm-nano-injection-overcomes-delivery-limitations-of-current-crispr-gene-editing-methods-accele (Consulté le 11 mars 2022)
Saha, P. et coll. (2020) Fondamentaux et applications de la technologie FluidFM dans les études unicellulaires. Adv. Copain. Interfaces 7, 2001115. Disponible à : https://doi.org/10.1002/admi.202001115
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Maître, A. et coll. (2009) FluidFM : combinaison de la microscopie à force atomique et de la nanofluidique dans un système de distribution de fluide universel pour les applications à cellule unique et au-delà. nano-lettres 9 (6), 2501-2507. Disponible en: https://doi.org/10.1021/nl901384x
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